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南京肽業(yè)YM說多肽|后修飾化學(xué)：在多肽樹脂上直接進行磷酸化、糖基化、脂質(zhì)化與聚乙二醇化

南京肽業(yè)YM說多肽

后修飾化學(xué)

在多肽樹脂上直接進行磷酸化、糖基化、脂質(zhì)化與聚乙二醇化

摘要

現(xiàn)代多肽化學(xué)的目標(biāo)，早已超越了對天然氨基酸序列的簡單復(fù)制。將多肽轉(zhuǎn)化為功能強大的生物探針或治療藥物，常常需要在其骨架上定點、特異性地引入化學(xué)修飾，如磷酸化、糖基化、脂質(zhì)化或聚乙二醇化。固相合成平臺為此提供了無與倫比的便利：允許在完全組裝好的肽鏈仍錨定在樹脂上時，進行一系列清潔、高效的衍生化反應(yīng)。本文將系統(tǒng)解析這四類關(guān)鍵后修飾的化學(xué)原理、保護基策略、活化方法以及固相實施的獨特優(yōu)勢與挑戰(zhàn)，展示如何將多肽從“裸序列”升級為結(jié)構(gòu)精巧的功能分子。

一、固相后修飾的核心理念與優(yōu)勢

在樹脂上進行后修飾（“on-resin”修飾）遵循一個清晰的化學(xué)邏輯：在完成線性肽鏈組裝后，選擇性地脫除目標(biāo)位點的正交保護基，暴露出特定的反應(yīng)性官能團（如氨基、羧基、巰基、羥基），然后與攜帶相應(yīng)活化基團的修飾分子進行反應(yīng)。

相較于溶液相修飾的顯著優(yōu)勢：

1. 過量化驅(qū)動：可過量使用昂貴的修飾試劑，以驅(qū)動反應(yīng)完全，反應(yīng)后通過簡單過濾去除。

2. 簡化純化：中間體無需分離純化，所有步驟在同一反應(yīng)器中進行，極大簡化了流程。

3. 減少產(chǎn)物損失：避免了多次轉(zhuǎn)移和溶液相純化帶來的物料損失。

4. 易于自動化：可與自動合成儀流程集成。

成功的關(guān)鍵前提：在初始序列設(shè)計中，就必須為目標(biāo)修飾位點引入正交保護基，以確保能在保留其他所有側(cè)鏈保護的情況下，選擇性暴露該位點。

二、四大修飾類型的化學(xué)實施詳解

1. 磷酸化修飾

• 目標(biāo)：在Ser、Thr或Tyr的羥基上引入磷酸基團。

• 構(gòu)件與保護：通常直接使用預(yù)制的磷酸化氨基酸單體，如 Fmoc-Ser(PO(OBzl)OH)-OH。磷酸上的兩個羥基用芐酯保護。

• 固相后修飾策略：

  • 若序列中所有磷酸化位點已通過預(yù)制單體引入，則只需在最終切割時，通過氫解或強路易斯酸處理（如TMSBr）同時脫除芐基，得到磷酸化肽。

  • 若需在合成后引入，則需在相應(yīng)位置使用帶正交保護基的氨基酸（如Fmoc-Ser(tBu)-OH），合成后選擇性地脫除該Ser的tBu，暴露出羥基，然后用磷?；噭?/span>（如二芐基-N,N-二異丙基亞磷酰胺，在四唑活化下，隨后氧化）在樹脂上進行磷酰化。

• 挑戰(zhàn)：磷酸基團在強酸下不穩(wěn)定，需優(yōu)化最終切割條件或采用分步脫保護策略。

2. 糖基化修飾

• 目標(biāo)：在Ser/Thr（O-連接）或Asn（N-連接）上引入糖鏈。

• 構(gòu)件策略（主流）：使用全保護的糖氨基酸單體。例如，Fmoc-Ser(Ac?-β-D-GlcNAc)-OH，其中糖環(huán)所有羥基被乙?；Ｗo。

  • 優(yōu)勢：將最復(fù)雜的糖化學(xué)問題在單體合成階段解決，固相合成中僅視為一個特殊氨基酸進行偶聯(lián)。

  • 后處理：合成后，在樹脂上或切割后，用溫和的堿（如甲醇鈉/甲醇）脫除糖環(huán)上的乙?；?，而不影響肽鏈。

• 樹脂上糖鏈延伸（高級）：在暴露出特定羥基的糖肽樹脂上，可使用糖化學(xué)方法（如糖基三氯乙酰亞胺酯供體）進行糖鏈的進一步延伸，但這屬于高度專業(yè)化的領(lǐng)域。

3. 脂質(zhì)化修飾

• 目標(biāo)：在N端或Lys側(cè)鏈引入脂肪酸（如豆蔻酸、棕櫚酸）或異戊二烯基團，以促進膜錨定或蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。

• 標(biāo)準(zhǔn)方法：

  1. 在目標(biāo)位點（如某個特定Lys）使用正交保護基，如Fmoc-Lys(Dde)-OH或Fmoc-Lys(Mtt)-OH。

  2. 完成主鏈合成后，用2%肼或1% TFA/DCM選擇性脫除該保護基，暴露出ε-氨基。

  3. 將脂肪酸（如豆蔻酸）用HATU或DIC活化后，與樹脂上的游離氨基反應(yīng)，形成酰胺鍵。

• 特點：反應(yīng)高效、直接，是制備脂肽疫苗或膜肽探針的常規(guī)操作。

4. 聚乙二醇化

• 目標(biāo)：在特定位點連接PEG鏈，以改善多肽的藥代動力學(xué)性質(zhì)（增加水溶性、延長半衰期、降低免疫原性）。

• 化學(xué)連接：

  • 氨基PEG化（最常見）：與脂質(zhì)化類似，在正交脫保護的Lys或N端，與活化的單甲氧基PEG-琥珀酰亞胺酯反應(yīng)。

  • 巰基PEG化：在Cys位點，使用馬來酰亞胺活化的PEG，通過邁克爾加成反應(yīng)進行特異性、高效的連接。

  • 點擊化學(xué)PEG化：在多肽中引入炔基或疊氮手柄，與互補手柄的PEG通過銅催化或應(yīng)變促進的炔-疊氮環(huán)加成反應(yīng)連接，條件溫和，特異性極高。

• 位點特異性：固相后修飾確保了PEG化發(fā)生在設(shè)計位點，避免了隨機修飾導(dǎo)致的異質(zhì)性混合物。

三、正交保護基設(shè)計：后修飾的藍圖

所有固相后修飾都始于精妙的保護基設(shè)計。下表展示了一個多功能化多肽的完整正交保護藍圖示例：

合成順序：需按脫除條件從最溫和到最劇烈的順序進行修飾。例如，先進行Mtt脫除/脂質(zhì)化（條件最溫和），再進行Dde脫除/熒光標(biāo)記，最后切割并進行巰基PEG化。

四、實施流程與關(guān)鍵考量

標(biāo)準(zhǔn)操作流程：

1. 設(shè)計與組裝：根據(jù)上述藍圖完成全保護肽鏈的固相合成。

2. 順序脫保護與修飾：

   • a. 用1% TFA/DCM處理，脫Mtt，洗滌后，進行脂質(zhì)化反應(yīng)。徹底洗滌。

   • b. 用2%肼/DMF處理，脫Dde，洗滌后，進行熒光標(biāo)記反應(yīng)。徹底洗滌。

3. 全局切割與部分脫保護：用標(biāo)準(zhǔn)TFA cocktail切割，脫除所有tBu, Pbf, Trt等保護基，肽鏈釋放，Cys巰基游離，磷酸基仍為芐酯保護。

4. 溶液相修飾與最終脫保護：

   • 在純化前或純化后，將多肽與馬來酰亞胺-PEG在緩沖液中反應(yīng)，完成PEG化。

   • 最后，通過催化氫化脫除磷酸基上的芐酯保護。

關(guān)鍵考量：

• 溶劑兼容性：確保修飾試劑和反應(yīng)條件與樹脂及剩余保護基兼容（如避免使樹脂收縮或破壞其他保護基的溶劑）。

• 監(jiān)測反應(yīng)：對于關(guān)鍵的后修飾步驟，可取樣進行質(zhì)譜分析，確認修飾是否成功及完全。

• 純化策略：高度修飾的多肽可能具有獨特的疏水/親水性，需調(diào)整HPLC純化條件。

五、未來趨勢：生物正交化學(xué)與酶催化

• 生物正交化學(xué)：如疊氮-炔環(huán)加成，為在復(fù)雜生物環(huán)境中進行特異、溫和的后修飾提供了強大工具，也適用于固相合成。

• 酶催化修飾：利用轉(zhuǎn)移酶在樹脂上或切割后進行特異性修飾（如糖基化、乙?；?，具有極高的區(qū)域和立體選擇性。

結(jié)論

在樹脂上進行后修飾化學(xué)，是多肽固相合成平臺功能的終極延伸。它將這個平臺從一個線性聚合器，轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€多功能分子工作站。通過將正交保護基設(shè)計與現(xiàn)代有機合成、生物綴合化學(xué)相結(jié)合，我們能夠以模塊化、程序化的方式，為多肽骨架精準(zhǔn)安裝各種功能“配件”。這不僅極大地豐富了多肽作為研究工具和藥物的結(jié)構(gòu)多樣性，更代表了一種高度匯聚式的合成哲學(xué)：先高效構(gòu)建公共骨架，再個性化定制功能末端。掌握這門化學(xué)，意味著能夠直接交付“即用型”生物活性分子，極大地加速從序列設(shè)計到功能應(yīng)用的研究進程。

南京肽業(yè)YM說多肽|后修飾化學(xué)：在多肽樹脂上直接進行磷酸化、糖基化、脂質(zhì)化與聚乙二醇化